技術(shù)文章/ARTICLES

    通過生化和遺傳學(xué)研究表明，RNA干擾包括起始階段和效應(yīng)階段(inititation and effector steps)。在起始階段，加入的小分子RNA被切割為21-23核苷酸長(zhǎng)的小分子干擾RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。證據(jù)表明；一個(gè)稱為Dicer的酶是RNase III家族中特異識(shí)別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴方式逐步切割由外源導(dǎo)入或者由轉(zhuǎn)基因，病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降 解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個(gè)片段的3’端都有2個(gè)堿基突出。細(xì)胞

    在RNAi效應(yīng)階段，siRNA雙鏈結(jié)合一個(gè)核酶復(fù)合物從而形成所謂RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-induced   silencingcomplex, RISC）。激活RISC需要一個(gè)ATP依賴的將小分子RNA解雙鏈的過程。激活的RISC通過堿基配對(duì)定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上，并在距離 siRNA3’端12個(gè)堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機(jī)制尚不明了，但每個(gè)RISC都包含一個(gè)siRNA和一個(gè)不同于Dicer的RNA酶。

    另外，還有研究證明含有啟動(dòng)子區(qū)的dsRNA在植物體內(nèi)同樣被切割成21-23nt長(zhǎng)的片段,這種dsRNA可使內(nèi)源相應(yīng)的DNA序列甲基化,從而使啟動(dòng)子失去功能,使其下游基因沉默.
實(shí)驗(yàn)步驟

1. siRNA的設(shè)計(jì)

1) 在設(shè)計(jì)RNAi實(shí)驗(yàn)時(shí)，可以先在以下進(jìn)行目標(biāo)序列的篩選：

2) RNAi目標(biāo)序列的選取原則：

A.從轉(zhuǎn)錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA"二連序列，并記下其3'端的19個(gè)堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點(diǎn)。有研究結(jié)果顯示 GC含量在45%-55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效。設(shè)計(jì)siRNA時(shí)不要針對(duì)5'和3'端的非編碼區(qū)（untranslated regions，UTRs)，原因是這些地方有豐富的調(diào)控蛋白結(jié)合區(qū)域，而這些UTR結(jié)合蛋白或者翻譯起始復(fù)合物可能會(huì)影響siRNP核酸內(nèi)切酶復(fù)合物結(jié) 合mRNA從而影響siRNA的效果。細(xì)胞

B. 將潛在序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（人，或者小鼠，大鼠等）進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。

C. 選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。通常一個(gè)基因需要設(shè)計(jì)多個(gè)靶序列的siRNA，以找到zui有效的siRNA序列。

3) 陰性對(duì)照

    一個(gè)完整的siRNA實(shí)驗(yàn)應(yīng)該有陰性對(duì)照，作為陰性對(duì)照的siRNA應(yīng)該和選中的siRNA序列有相同的組成，但是和mRNA沒有明顯的同源性。通常做法是將選中的siRNA序列打亂，同樣要檢查結(jié)果以保證它和目的靶細(xì)胞中其他基因沒有同源性。