1)訓練目的

    了解細胞活性檢查的原理；掌握染料的配制方法；掌握細胞活性檢查方法。

2)實驗原理

    細胞損傷或死亡時，某些染料可穿透變性的細胞膜，與解體的DNA結(jié)合，使其著色。而活細胞能阻止這類染料進入細胞內(nèi)，因此可以鑒別死細胞與活細胞。常用的染料有臺盼藍、苯胺黑、結(jié)晶紫。

3)實驗材料

①臺盼藍、苯胺黑、結(jié)晶紫溶液(溶于Hank's液或BSS液)。

②冷凍復(fù)蘇后的細胞或其他培養(yǎng)細胞。

③研缽、濾紙、漏斗、試劑瓶、標簽紙、顯微鏡、膠頭滴管、鑷子、載玻片、蓋玻片、計數(shù)器。

4)操作步驟

(1)配制染色液

①0.5％臺盼藍法：0.5g臺盼藍加熱溶于100 mLHank's液或BSS液中，貼標簽。

(1)0.05％苯胺黑：0．05 g苯胺黑充分研磨后溶于100 mL Hank's液或BSS液中。苯胺黑對細胞毒性小，但溶解度差．配制后需過濾，貼標簽。

③0.1％結(jié)晶紫(用BSS液配制)法：0.1g結(jié)晶紫分別研磨溶于．100mL Hank's液或BSS液中，過濾后貼標簽。

(2)制備細胞懸液

調(diào)整細胞濃度在1×106個／mL左右。

(3)染色

①0．5％臺盼藍法：取少量細胞懸液，按l：1量加入0．5％臺盼藍染色液，充分混勻。靜置15 min，用膠頭滴管吸取細胞懸液，滴1滴于載坡片上，加蓋玻片。1 min后用10x物鏡移動視野觀察，計數(shù)100～200個細胞。活細胞圓形透明，死細胞染成藍色，用活細胞占計數(shù)細胞中的百分比表示細胞活力。

②0．05％苯胺黑法：使用時，苯胺黑液與細胞懸液以1：10混合，稍放置后鏡檢，死細胞染成黑色，活細胞不著色。

③0.1％結(jié)晶紫法：細胞懸液與結(jié)晶紫液等量混合后，立即鏡檢，著紫色的為活細胞。

5)注意事項

①染色時間不能太長，否則活細胞也會逐漸積累染料而染成顏色，使檢測結(jié)果偏低。

②可結(jié)合細胞計數(shù)方法，同時進行細胞計數(shù)和活力檢測。

③細胞活性檢查是細胞培養(yǎng)的基本技術(shù)。它是檢測不同藥物、生化物質(zhì)處理等效果的直觀簡便手段，也是評定細胞冷凍效果的方法之一。在細胞凍存和復(fù)蘇過程中，由于細胞遭受非生理性的低溫打擊等，不可避免地對細胞產(chǎn)生影響，引起部分細胞活力下降或死亡，通過細胞活性檢查可快速檢驗細胞冷凍效果，是衡量細胞凍存、復(fù)蘇效果的一種簡便易行的方法：染料排除法是檢查細胞活性常用的方法。

④檢查貼壁的細胞時，應(yīng)先將細胞消化然后再進行操作。