技術(shù)文章/ARTICLES

    本實(shí)驗(yàn)要加入PSV2-neo、DNA與外源DNA共轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞，這樣可使受體細(xì)胞獲得新霉素(neo)基因的抗藥性，這樣即使癌基因沒有出現(xiàn)明顯的“轉(zhuǎn)化灶”，也可測出轉(zhuǎn)入的外源性基因的抗neo的標(biāo)記。而且還可利用被neo基因?qū)氲氖荏w細(xì)胞通過G418選擇培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)化的細(xì)胞建立細(xì)胞株。若以獲取 “轉(zhuǎn)化灶”為目的，可不加入PSV2-neo DNA只需將從癌細(xì)胞中提取的基因組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞即可，其方法如下： 

1.基因組DNA轉(zhuǎn)染： 

(1)配制磷酸轉(zhuǎn)染液 

NaCl 8.0g 

Hepes 5.0g 用時現(xiàn)配，pH很重要一定要控制在6.95±0.65 

Na2HPO4 0.099g 消毒滅菌 -20℃貯存?zhèn)溆?nbsp;

加溫水至 1000mL 

(2)按前面介紹的方法提取癌細(xì)胞基因組DNA。 

(3)取供體基因組DNA50～100μg,加3M NaCl或醋酸鈉，使zui終濃度至0.3M混勻。 

(4)再加2倍體積無水乙醇3000r/min離心10分鐘，去上清。 

(5)加入轉(zhuǎn)染緩沖液，待DNA充分溶解后，再加入2.5MCaCl2,含zui終濃度為125mM，用吸管輕輕吹打三次(不用攪拌器以防DNA袢結(jié))，置室溫下10～30分鐘，待液體透明度降低，出現(xiàn)微濁蘭色時，即可用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 

(6)取生長狀態(tài)良好處于半?yún)R合階段的對數(shù)生長期細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前4小時，更換培養(yǎng)液(5ml/瓶)1次。 

(7)轉(zhuǎn)染：向每瓶中加DNA-磷酸鈣沉淀物0.5～1mL/瓶，置37℃作用4～6小時。 

(8)培養(yǎng)：棄去培養(yǎng)液，用15%甘油處理3分鐘，無血清培養(yǎng)漂洗1次，接近匯合時血清用量降至5%，培養(yǎng)2～3周。 

(9)檢測：逐日觀察，待出現(xiàn)“轉(zhuǎn)化灶”后，克隆分離，擴(kuò)大培養(yǎng)建立轉(zhuǎn)化細(xì)胞株。